Institute of Chemical Engineering
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Rekombinante funktionell aktive Auronsynthasen

Projektnummer P 28795 (FWF Einzelprojekt)

 

Information on this project are currently only available in German language.

Aurone sind mit den Flavonoiden biochemisch verwandte gelbe Blütenpigmente, die der Anlockung von Bestäubern dienen. Darüber hinaus sind sie von großem pharmakologischem und biotechnologischem Interesse. Es gibt zwei Grundtypen, 4-Hydroxyaurone und
4-Deoxyaurone, die sich durch das Hydroxylierungsmuster an der Position 4 im A-Ring unterscheiden. Die Biosynthese der 4-Hydroxyaurone wurde im Löwenmäulchen (Antirrhinum majus) sehr gut untersucht. Die Auronbildung wird von der sogenannten Aureusidine synthase (AmAS1) katalysiert, einer spezifischen Polyphenol oxidase (PPO) mit Monophenolaseaktivität. Dies ist einerseits ein neuer Enzymtyp in der Flavonoidbiosynthese und andererseits ein vielzitiertes Beispiel für die Beteiligung von PPOs im Anabolismus. Die 4-Deoxyaurone wurde hingegen lange Zeit vernachlässigt, weil davon ausgegangen wurde dass ihre Biosynthese analog erfolgt. Kürzlich konnten wir jedoch zeigen, dass die Bildung der 4-Deoxyaurone sich in wesentlichen Punkten von der der 4-Hydroxyaurone unterscheidet, wie z.B. dem Enzymtyp, Substratspezifität und Lokalisation des Enzyms. Dieses Projekt soll offene Fragen der 4-Deoxyauronbiosynthese klären.

 

Da bislang neben der AmAS1 nur zwei weitere cDNA Klone aus Coreopsis grandiflora isoliert wurden, CgAUS1 und CgAUS2, sollen zunächst weitere Vertreter von Auronsynthasen aus anderen Pflanzen isoliert werden um die Unterschiede zwischen den beiden Auronbiosynthesewegen besser untersuchen zu können. Da im Gegensatz zur CgAUS1, AmAS1 und CgAUS2 aus Blütenblättern nicht in ausreichenden Mengen isoliert werden können, sollen die Arbeiten zur Substratspezifität und Enzymstruktur mit rekombinanten Enzymen durchgeführt werden. Auronsynthasen werden, wie PPOs im allgemeinen, in einer aktiven Proenzymform (latente PPO) gebildet, die durch proteolytischen Schneiden des C-Terminus in aktive Enzyme überführt werden. Daher sollen Vektorkonstrukte hergestellt werden, bei denen in den PPO Genen Schnittstellen für ein gezieltes Schneiden mittels PreScission protease eingebaut sind, um die natürliche proteolytische Prozessierung nachzustellen. Die Substratspezifität der rekombinanten CgAUS2 wird im Detail untersucht und Unterschiede zu CgAUS1, AmAS1 und anderen unspezifischen PPOs analysiert. Rekombinante aktive und latente CgAUS2 wird in größeren Mengen für Kristallisationsversuche gereinigt werden. Das Ziel ist es, Unterschiede zwischen der bereits vorhandene Kristallstruktur der Chalconspezifischen CgAUS1 und der CgAUS2, die vermutlich eine breitere Substratspezifität aufweist, zu identifizieren, um Struktur/Funktionsunterschiede von PPOs besser verstehen zu können. Das Projekt schafft wesentliche Vorrausetzungen um Funktionen und Strukturen dieser wichtigen Enzymklasse  mittels rekombinanten Proteinen untersuchen zu können.

Leitung und Kontakt:

Privatdoz. Dipl.-Ing. Dr.techn. Heidrun Halbwirth

Executive Senior Researcher

Projektass.(FWF) Dipl.-Chem. Dr.rer.nat. Christian Molitor

Co-workers:

Projektass.(FWF) Dipl.-Ing. Silvija Miosic

Projektass.(FWF) Jürgen Greiner